液相色譜儀是屬于易學(xué)難用的儀器，特別講究“正確使用”和經(jīng)驗(yàn)。
液相工作者接觸多的是流動(dòng)相，也就是流動(dòng)相，是造成液相色譜儀各種問題的主要源頭。
液相色譜儀常見的故障一是堵，二是漏。下面就這兩點(diǎn)分別展開討論。(注：流動(dòng)相以甲醇為例，色譜柱以C18為例)
一.先聊聊“堵”的情況
“堵”的表現(xiàn)現(xiàn)象就是柱壓異常升高，直接原因就是流路不暢。堵塞的主要位置就是在色譜柱的前端，主要原因就是流動(dòng)相里有雜質(zhì)，雜質(zhì)的主要來源就是細(xì)菌。
“堵”的原因之一：配制流動(dòng)相時(shí)細(xì)菌污染
首先，我們要認(rèn)識(shí)到，一般的國產(chǎn)甲醇其實(shí)不需要額外過濾處理，直接使用沒有問題。即使是有些固態(tài)微粒雜質(zhì)，也能在液相流路系統(tǒng)前端的過濾頭上排除，真正容易引起問題的，是水中的細(xì)菌。
新制備的純水在室內(nèi)放置幾天就會(huì)長菌，而這些細(xì)菌雖然肉眼不可見，卻足以堵塞柱填料顆粒的空隙，造成柱子很快報(bào)廢。這就是在配制流動(dòng)相時(shí)造成的細(xì)菌污染的原因，解決它的方法很簡(jiǎn)單，就是確保水的可靠性。這里有兩種方式推薦：
(1)理想的方式當(dāng)然是購買實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)，既方便又可靠，質(zhì)量也放心。它的缺點(diǎn)就是價(jià)格不菲。
(2)成箱購買市售品牌純凈水，如，500mL一支的怡寶或娃哈哈，這些水的質(zhì)量足以應(yīng)付液相色譜的要求。先隨機(jī)抽取一支做一下細(xì)菌平板實(shí)驗(yàn)，待菌落數(shù)合格方可使用。這樣每次只要單獨(dú)開一支即可，也很方便。每次成本2元左右。
※這里特別指出一個(gè)細(xì)節(jié)：在絕大多數(shù)書本上，凡談到配制流動(dòng)相都會(huì)談到后有一個(gè)過濾的步驟。但是從我們長期使用的實(shí)際效果來說，只要能保證水的質(zhì)量，這一步*可以也應(yīng)當(dāng)去除。
原因有以下三點(diǎn)：
(1)流動(dòng)相過濾在理論上有好處，但是，實(shí)際操作時(shí)由于不可能做到專瓶，反而容易造成的交叉污染，對(duì)于配比復(fù)雜的流動(dòng)相影響更大。
(2)流動(dòng)相過濾在經(jīng)濟(jì)成本上不劃算。買一套過濾裝置要6000多元，且過濾器*是比較容易損壞的設(shè)備。主要是過濾片的成本太高，一片就要幾十元。按一般液相柱的正常使用壽命計(jì)算，過濾片的成本會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于色譜柱的成本。
(3)流動(dòng)相過濾對(duì)于工作效率成本不劃算。使用溶劑過濾器有一個(gè)預(yù)清洗、裝備、使用、用后清洗，晾干的過程，至少也有一個(gè)小時(shí)的時(shí)間。這個(gè)成本也不能忽視。
(4)在實(shí)際工作未發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相不過濾會(huì)對(duì)柱壽命有任何影響。我們起碼有6年時(shí)間沒有做過流動(dòng)相過濾的工作，但是和國內(nèi)同行相比較，在同等使用強(qiáng)度下我們的柱壽命是比較長的。
“堵”的原因之二：使用流動(dòng)相時(shí)的細(xì)菌污染。
指的是：
流動(dòng)相剛開始沒有長菌，在使用時(shí)卻產(chǎn)生了細(xì)菌污染。這主要是在使用多元液相色譜儀時(shí)的一種不良使用習(xí)慣造成的。
舉個(gè)簡(jiǎn)單的例子：
50%的甲醇水流動(dòng)相，有兩種使用方式。一種方式是在上機(jī)前就配好混合在一起，另一種方式是在流路A放純甲醇，流路B放純水。
從單純實(shí)驗(yàn)效果來說，后一種有明顯的優(yōu)點(diǎn)：首先是簡(jiǎn)單，不需要實(shí)驗(yàn)者另個(gè)計(jì)算配比混合，其次就是比例準(zhǔn)確，能得到保留時(shí)間重復(fù)性*的實(shí)驗(yàn)效果。
但是，它有一個(gè)致命的缺陷，就是純水在流動(dòng)相瓶中幾天時(shí)間就會(huì)長細(xì)菌(很多情況下不僅僅用純水作流動(dòng)相，而是用緩沖鹽溶液，本身就是優(yōu)質(zhì)肥料，細(xì)菌長得更迅速)，一旦有細(xì)菌柱子就壞得很快。所以這種方式要求操作人員每次實(shí)驗(yàn)都要用新制備的純水，更要求在每次實(shí)驗(yàn)后把水相換掉，換成甲醇沖洗干凈，這一點(diǎn)在實(shí)際工作中很多人意識(shí)不強(qiáng)，就是意識(shí)到了但多次使用中總有一兩次會(huì)遺漏，但是往往這一兩次就足以產(chǎn)生致命的影響。因?yàn)橐合嗌V柱的堵塞是不可逆的。
所以，寧可犧牲小小的保留時(shí)間的重復(fù)性，也不要用純水溶液作為流動(dòng)相的一組。從實(shí)際實(shí)驗(yàn)效果來說，我建議用10%的甲醇水代替純水溶液(以前我做過不同比例甲醇水的細(xì)菌總數(shù)實(shí)驗(yàn)，在5%就基本可以抑菌，在10%及以上就可以*殺菌了)，這樣可以有效排除長細(xì)菌的隱患，既可作流動(dòng)相，也可沖柱。就算是在配制流動(dòng)相時(shí)會(huì)計(jì)算得麻煩一些，但是一次麻煩，終身受益。
“堵”的原因之三：不適當(dāng)操作。
常見問題的有以下幾種：
(1)在更換零件時(shí)選擇的型號(hào)有誤，接口不是很匹配，在擰緊的時(shí)候產(chǎn)生變形而使得管路堵塞。
(2)樣品處理液凈化得不干凈，長期會(huì)在六通閥和柱之間形成阻塞不暢。
(3)在使用手動(dòng)六通閥時(shí)，有些人可能由于手勁小的原因，轉(zhuǎn)動(dòng)的不到位，于是造成流路形成了死堵，壓力快速升高超過警戒值。
(4)在使用金屬管路作出廢液管時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意好廢液瓶中先放一些水，并把廢液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且實(shí)驗(yàn)使用較高濃度的緩沖鹽溶液，在停機(jī)時(shí)可能在出口端結(jié)晶成塊并造成堵塞。這種情況不常見，但卻的確發(fā)生過。
“堵”的原因講了不少，現(xiàn)介紹查堵的方法。
在發(fā)生“堵”的現(xiàn)象后，就需要找出原因，主要是什么位置發(fā)生了“堵”。注意，絕大多數(shù)情況下，整個(gè)系統(tǒng)只會(huì)有一個(gè)地方發(fā)生堵塞。
查堵的方法是從尾向前逆向分段拆開，仔細(xì)觀察壓力數(shù)值，如果某一個(gè)部件(柱子除外)裝上和拆下時(shí)的壓力差別很大，可發(fā)展變化判斷。至于柱的堵塞，可以通過換同樣規(guī)格的柱的壓力是否一致來判斷。
下面再談一下“漏”的問題。“漏”分兩種：漏液和漏氣。
一、漏液
液相色譜儀從流動(dòng)相瓶到廢液瓶之間的流路是一個(gè)全封閉體系，內(nèi)部壓力很高，但外部卻能保證一滴不漏。如果某個(gè)部件發(fā)生了漏液，那就是故障所在。
漏液的原因分兩種：
(1)接觸硬件不當(dāng)
在更換零件如流路管或換柱時(shí)，換的接頭接口不匹配，造成漏液。要注意不同公司的柱子接頭很多是不同的，甚至同一家公司在不同時(shí)期生產(chǎn)的液相柱接頭也有很大區(qū)別。當(dāng)然選用PEEK接頭是一個(gè)較好的解決方法，不僅通用性好，而且靠手?jǐn)Q就能保證不漏液。
即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不當(dāng)也會(huì)漏液，一種不當(dāng)就是力度把握不好，擰得太緊或太松；另一種不當(dāng)就是致命的錯(cuò)誤：滑絲，這是往往是動(dòng)手能力不太強(qiáng)，螺絲釘很少擰的工作者犯的錯(cuò)誤，滑絲的后果不僅是漏液那么簡(jiǎn)單，常造成重要部件的報(bào)廢。解決這個(gè)問題只能靠惡補(bǔ)基本功來實(shí)驗(yàn)，那就是擰螺絲。
(2)使用儀器不當(dāng)
如果是輸送泵漏液，常見的原因就是在活塞位置緩沖鹽析出造成。
析出的原因有兩個(gè)，一是使用緩沖鹽溶液時(shí)突然加入了純甲醇而析出，這種錯(cuò)誤很容易避免，這是盡量不要用純的甲醇和純水。只要互相有10%的比例就不會(huì)出現(xiàn)這個(gè)問題。另一原因是在用緩沖鹽溶液(不論甲醇含量有多少)作流動(dòng)相時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后沒有換甲醇水沖洗，使得微滲的流動(dòng)相干燥形成晶體造成。
不過，輸送泵漏液并不是非得馬上修不可，沖洗干凈并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。
檢測(cè)器漏液是個(gè)很麻煩的事，一般都是吸收池的問題，更換的費(fèi)用相當(dāng)高。但是并不是說一定要馬上更換，還可以從實(shí)際實(shí)驗(yàn)效果看能否湊合使用。
二.漏氣
漏液是從內(nèi)部向外漏，而漏氣則是外部的氣體進(jìn)入液相色譜儀的流路內(nèi)部形成了氣泡。下面按流路的方向逐個(gè)部件分析產(chǎn)生氣泡的原因和相應(yīng)解決方法。
1.過濾頭
抽液時(shí)，在流路管中有不規(guī)則但持續(xù)的小氣泡產(chǎn)生，這時(shí)考慮的是流動(dòng)相有沒有脫氣(需要特別提醒即使是有了真空脫氣機(jī)也是要先超聲脫氣的，起碼可以減少脫氣機(jī)的工作壓力并提高工作效率)，如果已經(jīng)脫了氣，則要注意過濾頭的污染也會(huì)造成這種現(xiàn)象。處理方法比較簡(jiǎn)單，擰下過濾頭在稀硝酸中浸泡，超聲半小時(shí)，洗凈后裝回去即可。
2.透明流路管
指的是在過濾頭和輸送泵之間的那一段管路。這一個(gè)部分往往不是有點(diǎn)氣泡，而經(jīng)常是整個(gè)管中全是空氣而操作人員卻渾然不知，以致輸送泵工作了半天才發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相瓶里的液體一點(diǎn)也沒少。這也是我們常說的液相色譜儀至少一周要開機(jī)一次的原因(我們做液相一定要有“微滲”的概念)。如果長時(shí)間不用，這一段管路的液體會(huì)*干掉，而充滿空氣的管路和充滿液體的管路不仔細(xì)看是分辨不出的。
這種情況對(duì)于輸送泵很危險(xiǎn)，因?yàn)?，泵從設(shè)計(jì)來說是輸送液體而不是氣體，內(nèi)部的液體對(duì)于活塞來說起到了機(jī)油的作用，如果活塞桿上還殘存了一些緩沖鹽，則極易拉傷，造成不可逆轉(zhuǎn)的影響。
對(duì)于這種情況，要突出“預(yù)防為主”，如，液相色譜使用人員要相對(duì)固定和穩(wěn)定，工作中合理搭配資源，每臺(tái)機(jī)一周擊至少作一次實(shí)驗(yàn)，如長期不用起碼每周要沖流動(dòng)相2 小時(shí)。養(yǎng)成良好的工作習(xí)慣很重要。
如果不慎出現(xiàn)了這種問題怎么辦？我的建議是用外力使管路中充滿液體。具體如下：
(1)找到流路管進(jìn)入輸送泵的接頭。
(2)擰下來。
(3)用一干凈的洗耳球的對(duì)準(zhǔn)管路的平整切口。
(4)吸液體，看液面從流動(dòng)相瓶里上升，至離洗耳球5 厘米左右時(shí)停止該動(dòng)作。
(5)快速把接頭擰回輸送泵上(這個(gè)過程可能會(huì)有少許流動(dòng)相外泄，這是正?，F(xiàn)象)。
(6)開機(jī)，打開排液閥門，啟動(dòng)輸送泵。
(7)等排液管中流出的溶液沒有氣泡時(shí)，再關(guān)閉排液閥，儀器正常工作。
3.輸送泵和柱子
這些部分進(jìn)了氣泡一般不怕，沖掉就行。
4.檢測(cè)器
應(yīng)該說，整個(gè)流路中只要有一個(gè)氣泡都會(huì)在檢測(cè)器上得到強(qiáng)烈的信號(hào)反映，檢測(cè)器內(nèi)部的氣泡一般都能被沖走，但也有很難沖掉的殘留氣泡的情況。
如果檢測(cè)器里有殘留氣泡，會(huì)有特征明顯的表現(xiàn)形式，就是在走基線時(shí)會(huì)時(shí)不時(shí)間隔出現(xiàn)直上直下信號(hào)很大的信號(hào)峰。這時(shí)先看普通流量能否沖走，如果沖不走，那辦法就是拆柱，把檢測(cè)器直接連到輸送泵的出口，加大幾倍流量沖洗，則肯定能沖走氣泡。
